Рисунок 8. Денситограмма очищенного ферментного препарата ТПДО, полученная в результате капиллярного электрофореза.


Для определения молекулярной массы гомогенной нативной ТПДО использовали метод неденатурирующего электрофореза в присутствии ДДС-Na по методике А.В.Колесниченко и соавторов (2000). Неденатурирующим электрофорезом было показано, что нативная молекула ТПДО имеет молекулярную массу около 167 кДа (Рис. 9).

Для определения субъединичного состава и молекулярной массы субъединиц ТПДО использовали ДДС-Na-ПААГ электрофорез по Laemmli (1970). Гомогенный препарат ТПДО был восстановлен в присутствии 2 % ДДС-Na и 5 % 2-меркаптоэтанола и проанализирован в 10 % ПААГ. Было выявлено, что ТПДО состоит из двух субъединиц с молекулярной массой около 73 и 77 кДа, которые вероятно, связаны между собой SS мостиками, поскольку они восстанавливались 2-меркаптоэтанолом (Рис. 10).

Протеиндисульфидредуктаза, выделенная нами из зерновки пшеницы, имела более высокую молекулярную массу нативного белка и отдельных субъединиц по сравнению с ранее описанными глутатион-зависимыми протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Chandler, Varandani, 1975; Freedman, 1979), а также более высокую молекулярную массу по сравнению с уже известными в зерновке пшеницы ферментами SH-метаболизма.



1 2 1 2


Рисунок 9. Рисунок 10.

Неденатурирующий ДДС-Na–электрофорез ДДС-Na–электрофорез ТПДО зерновки

ТПДО зерновки пшеницы в 7 %-ном ПААГ; пшеницы по Laemmli в 10% -ном

1 – маркеры (ферритин -440 кДа, каталаза – ПААГ; 1– маркеры ( – глобулин –

223 кДа, лактатдегидрогеназа -140 кДа, 160 кДа; овальбумин – 45 кДа,

БСА -67 кДа); цитохром с – 12 кДа);

2 - нативная ТПДО 2 – ТПДО, восстановленная

- меркаптоэтанолом


Протеин дисульфид изомераза, очищенная Shimoni et al. (1995) из созревающей зерновки пшеницы, имела молекулярную массу 60 кДа. Тиоредоксинредуктаза пшеницы, по данным разных авторов, 35 или 65 кДа (Suske et al., 1979; Kobrehel et al., 1992). Тиолтранcфераза, состоящая из двух субъединиц с молекулярной массой около 23 кДa - около 50 кДа (Pascal et al., 1998). Хлоропластная глутатионредуктаза листьев пшеницы состояла из двух субъединиц с молекулярной массой 56 кДа и ассоциированным полипептидом 32 кДа, при общей молекулярной массе 150 кДа (Lascano et al., 2001). Известно, что типичные тиоредоксины и глутаредоксины представляют собой низкомолекулярные белки с молекулярной массой 11-14 кДа (Buchanan, Balmer, 2005; Rouhier, 2010).


Субстратная специфичность протеиндисульфидредуктазы, сродство

к инсулину и БСА

Субстратную специфичность определяли для стандартных субстратов: инсулина, имеющего три SS связи, две из которых - межмолекулярные и бычьего сывороточного альбумина (БСА), имеющего 17 внутримолекулярных SS связей, а также для уксуснорастворимых белков клейковины, в состав которых входят преимущественно низкомолекулярные глютенины.

В таблице 8 показано восстановление SS связей различных белков эндогенной гомогенной ТПДО зерновки пшеницы. В отсутствие GSH восстановления SS связей не происходило вовсе (1). Количество SH групп в инкубационной среде несколько снижалось, очевидно, за счет спонтанного окисления. Добавление к раствору инсулина восстановленного глутатиона в концентрации 1 мМ приводило к восстановлению SS связей инсулина, количество SH групп в инкубационной среде возрастало в течение часа со скоростью 12 10 мкмоль SH/мин (2).

Объединение в одной инкубационной среде инсулина, ТПДО и GSH приводило к десятикратному повышению скорости восстановления SS связей, до 138 10 мкмоль SH/мин (3). Подобные закономерности наблюдали при восстановлении дисульфидредуктазой SS связей БСА и уксуснорастворимых белков клейковины. GSH восстанавливал SS связи этих белков, однако добавление в инкубационную среду дисульфидредуктазы существенно повышало скорость реакции, в инкубационной среде с БСА - в 2 раза (5), с белками клейковины – почти в 4 раза (7).

Таблица 8. Содержание SH групп (мкмоль/мл) в аликвотах реакционной смеси (3, 5, 7) и контрольных вариантах (1, 2, 4, 6) в процессе инкубации ТПДО (0.02 мг/мл) с инсулином (4 мг/мл), БСА (19 мг/мл) и белками клейковины (4 мг/мл).





Состав инкубационной смеси

Время инкубации, мин

0 30 60

1

2

3

4

5

6

7



Инсулин, ТПДО

Инсулин, GSH

Инсулин, ТПДО, GSH

БСА, GSH

БСА, ТПДО, GSH

Белки клейковины, GSH

Белки клейковины, ТПДО, G SH

3.1 ± 0.0

2.1 ± 0.2

3.3 ± 0.2

14.4 ± 0.2

15.5 ± 0.2

5.3 ± 0.1

6.1 ± 0.0

-

-

-

17.5 ± 0.2

20.5 ± 0.2

5.5 ± 0.5

6.9 ± 0.4

2.7 ± 0.1

2.8 ± 0.2

11.6 ± 0.2

19.2 ± 0.9

24.5 ± 0.3

6.3 ± 0.8

9.7 ± 1.0


Представлены средние значения ± стандартное отклонение, n = 3

Максимальная скорость реакции восстановления SS связей инсулина наблюдалась при концентрации инсулина 3.1 мкМ, Km при этом составила 2.18 ± 0.2 мкМ, что в 5-10 раз меньше, чем значения Km для инсулина аналогичных ферментов из животных тканей (Shomburg et al., 1994). Для БСА при тех же условиях максимальная скорость реакции проявлялась при концентрации 700 мкМ, а Km составила 570 ± 15.7 мкМ. Сравнительно высокое сродство к инсулину делает ТПДО зерновки пшеницы сходной с протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Ansorge et al., 1973; Carmichael et al., 1979; Srivastava et al., 1991). Определение Km для запасных белков пшеницы затруднено из-за их плохой растворимости в средах, пригодных для определения активности ферментов, однако в таблицах 1 и 8 показано, что ТПДО специфична в отношении SS связей уксуснорастворимых белков клейковины.


Взаимосвязь активности дисульфидредуктазы и содержания низкомолекулярных тиолов в развивающейся зерновке

На рисунке 12 показана сопряженность активности ТПДО и содержания низкомолекулярных тиолов в развивающихся зерновках пшеницы. Средние данные для четырех сортов пшеницы приведены в % от суммарного содержания низкомолекулярных тиолов и суммарной активности ТПДО в зерновке на протяжении созревания.

Относительное содержание низкомолекулярных тиоловых соединений достигало максимума на стадии молочной спелости (примерно 30 день после цветения, влажность семян около 50 %), а с наступлением фазы тестообразной спелости снижалось. Максимум активности ТПДО совпадал с максимальным содержанием небелковых тиолов в зерновке (Рис. 12). Наличие достоверной корреляционной связи (r = 0.76, P




Рисунок 12. Активность ТПДО (1) и относительное содержание небелковых тиолов (2) в развивающихся зерновках пшеницы в зависимости

от влажности зерна. Приведены средние данные для сортов Скала, Ангара 86, Лютесценс 616Н5 и Эритроспермум 674Н27. Бары – стандартное отклонение.




Поскольку пул GSH в клетке поддерживается глутатионредуктазой, логично предположить, что обнаруженный нами фермент с протеиндисульфид редуктазной активностью относится к редуцирующей системе глутаредоксина. Нетипично высокая для глутаредоксинов молекулярная масса нативного белка ТПДО позволяет отнести дисульфидредуктазу из зерновки пшеницы к классу высокомолекулярных глутаредоксин подобных белков (Buchanan, Balmer, 2005), функционирующих в редуцирующей системе НАДФН/глутатионредуктаза/GSH/ТПДО.


Оптимумы рН, температуры и ингибиторный анализ тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы

Оптимальные для активности ТПДО значения температуры были определены в диапазоне 33-38° С, максимальная активность наблюдалась при 36° С. В этом у ТПДО из пшеницы больше сходства с ферментами тиол-дисульфидного метаболизма из животных тканей (Varandani, 1973), нежели с тиоредоксином h из зерновки пшеницы, имеющим температурный оптимум при 25 ° С (Suske et al., 1979). Оптимальные значения рН - в интервале 6.5-7.5, с максимальной активностью при рН 7.0. Значения рН оптимума для ТПДО пшеницы в целом сходны с таковыми для дисульфидредуктаз животных (Ansorge et al., 1973).

Для ингибиторного анализа мы использовали специфические реагенты на SH-группы (Табл. 9). Двухвалентные ионы меди и цинка, связывающие SH-группы с образованием меркаптидов, на 100 % ингибировали активность ТПДО. Алкилирующие агенты N- этилмалеимид (N-ЭМ) и п-хлормеркурибензоат (ПХМБ) также ингибировали активность ТПДО, причем N-ЭМ сильнее, что, вероятно, можно объяснить разной доступностью для этих соединений, SH групп активного центра (Табл. 9).

Таблица 9. Влияние ингибиторов на активность ТПДО из зерновки пшеницы.

Ингибитор

Концентрация, мМ

Ингибирование, %


CuSO4

0.5

100

1.0

100


ZnSO4

0.5

100

1.0

100


N-ЭМ

0.5

70

1.0

100


ПХМБ

0.5

20

1.0

53

Представлены средние значения из трех независимых экспериментов, стандартное отклонение меньше 10 %.


На основании ингибиторного анализа можно предположить, что ТПДО из зерновки пшеницы, является представителем суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз, имеющих в активном центре два цистеиновых остатка в тиоредоксинподобном домене –Cys-Х-Х-Cys- .


Влияние ТПДО из зерновки пшеницы на агрегирующую способность уксуснорастворимых запасных белков

Способность запасных белков к агрегации является одним из важных показателей, характеризующих реологические свойства теста и качество клейковины. Параметры агрегации белков сильных пшениц заметно выше по сравнению с таковыми слабых пшениц, причем в случае высококачественной клейковины процесс образования белковых агрегатов интенсивнее на начальных этапах и более продолжителен по времени (Arakawa, Yonezawa, 1975). На рисунке 13 А представлены результаты экспериментов, проведенные при рН 5.6, согласно стандартной методике (Arakawa et al., 1975, 1976). Агрегирующая способность запасных белков в присутствии ТПДО снижалась по сравнению с контролем. Различие в величине показателей агрегации 10 /C между контролем и опытом составляло в среднем от 15 до 22 %. Так, 10 /C за 10 мин составлял в контроле 134.1 ± 4.6, в опыте – 114.6 ± 1.2. В следующие 25 мин (до прекращения агрегации) соответственно 143.6 ± 5.1 и 119.4 ± 1.2. При оптимальной для активности ТПДО рН 7.5 (рис.13 (В)) показатель агрегации 10 /C в присутствии фермента снижался ещё больше, на 25-30 %, что, очевидно, связано с усилением диссоциации SS связей запасных белков под влиянием ТПДО.





Рисунок 13. Влияние ТПДО зерновки пшеницы на агрегацию уксуснорастворимых белков клейковины.

А-рН 5.6; В- рН 7.5. 1 – контроль (без ТПДО), 2- опыт (+ТПДО). Представлены средние данные из трех независимых экспериментов, ошибка не превышала 5%.

Заметное влияние ТПДО на агрегирующую способность запасных белков свидетельствует о важной роли дисульфидных связей в агрегации белков зерновки и потенциальной возможности регулирования агрегации белков с помощью ТПДО.


Влияние добавок экзогенной дисульфидредуктазы на физические свойства теста разнокачественных сортов пшеницы

На рисунке 14 представлены результаты определения силы муки, упругости и растяжимости теста на альвеографе Шопена до и после добавления в муку препарата очищенной дисульфидредуктазы. В муку до замеса теста добавляли частично очищенный из зерновки пшеницы (не содержащий примесей других ферментов тиол-дисульфидного метаболизма) препарат ТПДО в соотношении 5мг/50г муки.

Как видно из рисунка, добавление ТПДО не влияло на упругость теста ни одного из трех изученных сортов, но значительно увеличивало растяжимость теста - на 17 % у сорта Мироновская 808, имеющего высокую растяжимость, на 11 % у сорта Омская, клейковина которого отличалась очень высокой упругостью и малой растяжимостью, и почти на 50 % у озимого сорта Иркутская. У последнего сорта отношение упругости теста к растяжимости приближалось к единице, но сила муки была довольно низкой. Соответственно, для сортов Омская и Иркутская достоверно снижалось отношение упругость/растяжимость теста.

Таким образом, добавление к муке препарата очищенной ТПДО заметно изменяло физические свойства теста, увеличивая его растяжимость, что свидетельствует о специфичности ТПДО в отношении не только внутри- , но и межмолекулярных дисульфидных связей.







Рисунок 14. Влияние добавок ТПДО на физические свойства теста различных сортов пшеницы: 1- Мироновская 808, 2 – Омская, 3 – Иркутская. Представлены средние значения из трех повторностей ± стандартное отклонение. * - P